1 Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v32i2.20009 ARTÍCULO DE REVISIÓN Rol del ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos fina sangre de carrera. Uso de antiinflamatorios Role of the nuclear factor kappa Beta ligand (RANKL) in osteoarthritis and oseteoclastogenesis in thoroughbred horses. Use of anti-inflammatory drugs. Luis De Negri1,3, Luis Olguin1, Leonardo Pavez1,2 RESUMEN La osteoartritis (OA) es una de las principales afecciones que incide en el rendimien- to de equinos de deporte. El diagnóstico temprano de la enfermedad es relevante en su manejo clínico y terapéutico. La evidencia demuestra que este proceso tiene una clara relación entre osteoclastos y células inmune compartiendo moléculas como citoquinas, receptores, moléculas de señalización, factores de transcripción que se influencian mu- tuamente donde juegan un rol crucial tanto en la resorción ósea patológica como fisioló- gica. Se describe el rol del ligando del activador del receptor nuclear kβ (RANKL) como una de las citoquinas más relevantes que inducen osteoclastogénesis. Palabras clave: RANKL, osteoartritis, equinos, osteoclastogénesis, inflamación ABSTRACT Osteoarthritis (OA) is one of the main conditions that affects the performance of sports horses. Early diagnosis of the disease is relevant in its clinical and therapeutic management. The evidence shows that this process has a clear relationship between osteoclasts and immune cells sharing molecules such as cytokines, receptors, signaling 1 Núcleo de Investigaciones Aplicadas en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (NIAVA), Facultad de Medicina Veterinaria y Agronomía, Universidad de Las Américas, Santiago, Chile 2 Departamento de Ciencias Químicas y Biológicas, Universidad Bernardo O’Higgins, Santiago, Chile 3 E-Mail: dr.luisdenegri@gmail.com Recibido: 30 de abril de 2020 Aceptado para publicación: 18 de febrero de 2021 Publicado; 24 de abril de 2021 Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e200092 L. De Negri et al. molecules and transcription factors that influence each other where they play a crucial role in both pathological and physiological bone resorption. The role of the nuclear receptor activator ligand kβ (RANKL) is described as one of the most relevant cytokines that induce osteoclastogenesis. Key words: RANKL, osteoarthritis, equine, osteoclastogenesis, inflammation INTRODUCCIÓN En equinos de deporte, la principal cau- sa de invalidez funcional son las afecciones que comprometen el sistema músculo esque- lético (Martiq et al., 2014), donde la osteoartritis (OA) es una entidad patológica de gran incidencia y causa común de claudi- cación (Polli et al., 2013), dolor y efusión sinovial que reduce el rendimiento físico (de Souza, 2016; Stefaniuk-Szmukier et al., 2019) y pérdida de días de entrenamiento (Reed et al., 2012). Los ejemplares afectados en for- ma aguda presentan signos de inflamación en la articulación carpal, metacarpo falángica y tibiotarsal (Caggiano et al., 2013), no ha- biendo tratamiento curativo (Xie et al., 2019). El dolor es el síntoma cardinal de la ar- tritis relacionado directamente con la función y calidad de vida, cuya patogénesis se ha re- trasado en áreas como el control de la infla- mación, regulación de la autoinmunidad y falta de terapéutica. Sin embargo, se investigan los mecanismos biológicos y moleculares en di- ferentes modelos animales (Hong et al., 2020). Por décadas, las investigaciones rea- lizadas en torno a la inflamación articular pro- ducto del trauma repetitivo (McIlwraith, 2009; Goodrich y Nelson, 2013), se han orientado a conocer el rol del cartílago articular, líquido y membrana sinovial (Frisbie, 2012; Ross et al., 2012), pero no se ha estudiado debidamente lo que ocurre en el hueso subcondral de equinos con OA. La remodelación del hueso subcondral es un proceso biológico que compromete a células residentes de la médula ósea, que in- cluye osteoblastos, osteocitos, osteoclastos (Al- Bari y Al Mamun 2020) y células inflamatorias derivadas de células madre (stem cells) hematopoyéticas (Xie et al., 2019), que en la patogénesis de la OA apare- cen con una menor densidad mineral ósea y un incremento en los espacios del trabeculado, formando erosiones que se extienden a tra- vés del cartílago calcificado con orientación vertical en el hueso esponjoso (Lacourt et al., 2012). Su alteración arquitectónica reduce su habilidad para disipar las fuerzas y distribuir el impacto generado sobre la articulación, lo que se traduce en un aumento de las fuerzas biomecánicas sobre el cartílago articular ace- lerando el daño (De Simone et al., 2013). Los osteoclastos que participan en la osificación endocondral, remodelación ósea subcondral, reparación ósea y su densidad, es mayor en el plato óseo cortical subcondral (0.3 mm) comparado con el trabeculado óseo más profundo de grupos de potrillos, añeros y adultos (Gilday et al., 2020). Por otra par- te, Zarka et al. (2019) detectaron en el cartí- lago calcificado y hueso subcondral, microfracturas y aumento de la densidad de osteocitos en rodillas de cadáveres humanos donde estas pueden reflejar una vía en que el cartílago articular puede ser protegido del trau- ma disipando la energía en respuesta a la carga mecánica. En equinos, la OA se caracteriza por presentar sinovitis, alteración de la viscosi- dad del líquido sinovial y un lento y progresi- vo resquebrajamiento del cartílago hialino (Novakofsky et al., 2015). Además, se des- cribe en la etapa inicial inflamatoria el rol de 3Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 Ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos macrófagos sinoviales, macrófagos del tejido adiposo y osteoclastos (Xie et al., 2019) y, por otra parte, el compromiso de tejidos, tan- to articulares como periarticulares (Frisbie, 2012; Caggiano et al., 2013) que en el tiem- po van a presentar signos radiográficos de la enfermedad como osteofitos, esclerosis, quis- tes en el hueso subcondral, disminución del espacio articular y entesofitos (Milner, 2011; Lacourt et al., 2012) y en estados avanza- dos, erosión cartilaginosa y fibrosis de la mem- brana sinovial (De Simone et al., 2013; Goodrich y Nelson, 2013; Xie et al., 2019). Independiente de los avances en el diag- nóstico, las lesiones articulares se mantienen como un problema común en caballos de ca- rrera (Singer, 2013). Es así que en el Reino Unido, se encontró que el 24% de los caba- llos tuvo problemas articulares durante el en- trenamiento y las carreras (Reed et al., 2012). Asimismo, en Australia, se encontró que el 31% de los caballos de dos años en entrenamiento sufrió algún tipo de lesión arti- cular en las áreas que sustentan la carga mecánica, como ocurre en la superficie proximal del tercer hueso carpiano, la super- ficie distal del hueso carpo radial y el borde proximal de la primera falange (Reed et al., 2012). Respecto a fracturas por estrés, aso- ciadas con claudicación en caballos entrena- dos en diferentes superficies realizado en dos hospitales, uno en Toronto y otro en Pensil- vania, de un total de 528 cintigramas, hubo una mayor proporción (31.7%) de caballos fracturados entrenados en una superficie sin- tética en comparación a los entrenados en una superficie de tierra (MacKinnon et al., 2014). Es así que las afecciones músculo esqueléticas se orientan a los signos clínicos, diagnóstico y tratamiento (De Negri, 2006), pero no se cuenta con información de lo que ocurre a nivel molecular y los cambios inmunológicos que conllevan a la destrucción ósea; sin embargo, la evidencia indica que hay un sistema inmune y esquelético que com- parten una serie de moléculas que regulan su función como citoquinas, receptores, molé- culas de señalización y factores de transcrip- ción (Okamoto y Takayanagi, 2011). En este contexto, en la remodelación fisiológica del hueso participan dos tipos prin- cipales de células, los osteoblastos (OBs), que forman hueso nuevo y los osteoclastos (OCs) que reabsorben hueso dañado o viejo (Adamopoulos y Mellins, 2015). El desarro- llo progresivo de los OBs hasta su madurez se caracteriza por una expresión secuencial de genes que identifican tres periodos de de- sarrollo del fenotipo osteoblástico: prolifera- ción, maduración y síntesis de matriz extracelular (MEC) y mineralización de la matriz. Esto se hace controlando la remode- lación mediante 1) osteocalcina, 2) osteo- pontina, y 3) sialoproteína ósea, cuya función es promover la nucleación de cristales de hidroxiapatita y diferenciación de OBs, don- de la hormona calcitonina actúa sobre ellos aumentando su proliferación y la expresión de osteoprotegerina (OPG) RNAm, inhibien- do el ligando del receptor del factor nuclear kappa Beta (RANKL) (Neve et al., 2011). El proceso por el cual células madre hematopoyéticas se diferencian en OCs multinucleados con la función de reabsorber hueso, se define como osteoclastogénesis (Takanayagi, 2007). Los OCs tanto en la re- sorción fisiológica como patológica, tienen al ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) como la citoquina clave. Debido a la corta vida de los OCs, es- tos deben ser continuamente generados en o cerca del sitio de la resorción ósea donde OPG puede ser producida en la misma cer- canía de RANKL, por lo que su relación con OPG, es el mayor determinante de la magni- tud de formación de OCs y resorción ósea en ese lugar (O´Brien et al., 2013). Por otra parte, el esqueleto se adapta a las cargas mecánicas mediante la remodelación y los OCs que se encuentran cerca de las zonas de microdaño, donde se cree que inician la resorción ósea; sin embargo, la carga local mecánica como flujo de fluido regula el re- clutamiento y diferenciación de los precurso- Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e200094 L. De Negri et al. res de osteoclastos en el sitio de la resorción ósea a través de canales de calcio (Gao et al., 2019). Dos factores son esenciales y suficien- tes para promover la osteoclastogénesis: el factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF-1) y el ligando del receptor activador del factor nuclear kappa Beta (RANKL). Así, CSF-1 sustenta la proliferación de OCs y su sobrevivencia, mientras que RANKL induce la activación de la diferenciación de OCs, in- cluyendo la activación de genes necesarios para la resorción ósea y genes requeridos para la fusión de células progenitoras de monocitos (Levaot et al., 2015). Independiente de las actividades que ocurren en el hueso, la sinovia por su parte, se divide en dos compartimientos, donde la más externa (sub-íntima) con macrófagos especializados (sinoviocitos) y fibroblastos mantienen la homeostasis articular interna, donde estas últimas producen metalopro- teinasas de la matriz en los estados tempranos de la OA (Xie et al., 2019), y la más interna (íntima), que provoca dolor y alteración de la función, caracterizada por infiltración de neutrófilos, linfocitos T y monocitos, junto con aumento de la hiperplasia y vascularización de la membrana sinovial que incrementa la expresión de citoquinas catabólicas como interleuquina uno (IL-1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) secretadas por los condrocitos y aumento de la producción y li- beración de metaloproteinasas (MMPs) por condrocitos y sinoviocitos que degradan los componentes de la matriz extracelular (MEC) del cartílago (Frisbie, 2012). La presencia de Interleuquina uno Beta (IL-1β), se describe como una las citoquinas proinflamatorias más poderosas que estimu- la in vitro e in vivo la resorción ósea, regula la producción de OPG, aumenta la síntesis de prostaglandina E2 (PG E2 ), regula la diferen- ciación, activación y sobrevivencia de los osteoclastos, incrementa la producción del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), e inhibe la apoptosis de osteoclastos y los efectos de TNF en la osteoclastogénesis, de manera que sus efectos conducen a la resorción ósea y osteoporosis (Ruscitti et al., 2015). Los radicales libres por su parte, juegan un rol en la degradación del ácido hialurónico y del colágeno, donde la PG E2 está aumenta- da en el líquido sinovial de caballos con OA. Esto se ha correlacionado con sinovitis y clau- dicación clínica, los cuales pueden reaccio- nar con el óxido nítrico en las articulaciones dañadas provocando destrucción de la MEC y apoptosis de condrocitos, disminución de la deposición de sulfato dentro de las cadenas de glicosaminoglicanos, síntesis de colágeno y expresión de una importante citoquina antiinflamatoria, la antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra) (Carmona y Giraldo- Murillo, 2007). Abdelmagid et al. (2015) estiman que la inflamación crónica durante el envejeci- miento de una articulación se caracteriza por aumento de citoquinas proinflamatorias, pér- dida de hueso y disminución de la capacidad de reparación, lo que se asocia a un incre- mento de la osteoclastogénesis con profun- dos cambios metabólicos, estructurales y fun- cionales en el hueso, orientando el balance de la remodelación ósea hacia la resorción mediada por OCs. En este contexto, utilizan- do un modelo animal, se demostró que una vez instalada la artritis crónica, hay una re- ducción de la densidad ósea y un deterioro de las propiedades mecánicas del hueso como rigidez, ductilidad y resistencia; lo que refuerza la hipótesis de que una desregulación del sis- tema inmune afecta fuertemente el metabo- lismo del hueso, estructura y función (Caetano-Lopes et al., 2010). Por lo tanto, lo más importante en esta enfermedad, es realizar un diagnóstico y tra- tamiento precoz, para evitar la progresión de la OA (Kamm et al., 2013). Sin embargo, en los estados tempranos, el examen radiográfico se considera que tiene una baja sensibilidad (McIlwraith, 2009) y, por este motivo, las le- siones son diagnosticadas cuando ya se ha 5Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 Ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos producido un daño articular significativo (McIlwraith et al., 2012). En la actualidad, se cuenta con alternativas de diagnóstico, como es el uso de la ultrasonografía y reso- nancia magnética, las cuales pueden ser más precisas y sensibles en la detección de lesio- nes articulares, ya que permiten evaluar teji- dos blandos (Goodrich y Nelson, 2013), pa- sando a ser un buen complemento en el diag- nóstico. Rol de RANKL en la Osteoartitis y Osteoclastogénesis La homeostasis ósea es controlada en forma bien balanceada y dinámica entre osteoclastos, osteoblastos y osteocitos, don- de osteoclastos son células multinucleadas que degradan la matriz ósea. Si este balance implica una mayor resorción por osteoclastos sobre la formación de hueso por osteoblastos se traduce en una disminución de la matriz ósea (Al- Bari y Almamun, 2020). Es así, que la inflamación crónica determina cambios metabólicos estructurales y funcionales en el hueso orientando el balance de la remode- lación ósea hacia la resorción mediada por osteoclastos. En este contexto, utilizando un modelo animal se demostró que una vez ins- talada la artritis crónica hay una reducción de la densidad ósea y un deterioro de las pro- piedades mecánicas del hueso como rigidez, ductilidad y resistencia (Caetano-Lopes et al 2010). La diferenciación de OCs es regulada por el factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF) y el ligando del factor nuclear kappa beta (RANKL), una citoquina de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) (Asagiri y Takayanagi 2007), expre- sado por osteoblastos que forman hueso y sustentan la osteoclastogénesis (Adamo- poulos y Mellins 2015). En el hueso, la expresión de RANKL, que es una proteína de membrana tipo II, perteneciente a la superfamilia TNF locali- zada en la capa medias y profunda del cartí- lago hialino, correlaciona con la degeneración y densidad de osteoclastos (Bertuglia et al., 2016), permite la maduración, diferenciación y activación de estos mediante unión a su agonista el receptor del factor nuclear kappa Beta (RANK), que traduce sus señales reclutando moléculas adaptadoras como el factor asociado al receptor TNF (TRAF), donde TRAF-6 es el principal adaptador molecular que conecta RANK a la diferen- ciación y función de OCs (Nakashima et al., 2012). RANKL es expresado en condrocitos y fibroblastos sinoviales (Adamopoulos y Mellins, 2015), contribuyendo directamente en la destrucción del hueso (Nakashima et al., 2012); sin embargo, otros autores esti- man que RANKL es exclusivamente expre- sado en el tejido sinovial por linfocitos T acti- vados y fibroblastos sinoviales (Izquierdo y Pablos, 2013). RANKL es también expresa- do por otras células como monocitos, neutrófilos, células dendríticas, linfocitos B y T (Liu y Zhang, 2015). En consecuencia, de- terminar el origen de RANKL en la osteoartritis de equinos, probablemente cons- tituiría un gran desafío en estudios prospectivos. Por otra parte, los OBs juegan un rol crucial en la regulación de la resorción ósea por OCs mediante RANKL (Zupan et al., 2013). Los OBS, células gigantes multinucleadas son diferenciadas de precur- sores de stem cell hematopoyéticas en pre- sencia de factores esenciales como: el re- ceptor activador del factor nuclear κB (NF- κβ) ligando (RANKL), el cual es una citokina factor de la familia de necrosis tumoral (TNF) (Boyce et al., 2015) y OPG, un factor que ejerce un efecto protector en el hueso, la cual es una proteína soluble que tiene una alta si- militud con RANK y es un receptor miembro de la superfamilia TNF, con un importante rol en el sistema esquelético actuando como señuelo para el enlace RANK-RANKL (Neve et al., 2011). Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e200096 L. De Negri et al. OPG se une a RANK con alta especi- ficidad y de esta manera impide la diferen- ciación y activación de osteoclastos y pro- mueve su apoptosis y, por lo tanto, el balance entre RANKL y OPG determina la resor- ción ósea (Adamopoulos y Mellins, 2015). Es así, que la unión de RANKL a RANK es inhibida por el receptor señuelo OPG (Okamoto y Takayanagi, 2011), donde el sis- tema RANKL/RANK/OPG juega un rol cla- ve en la formación, activación y sobrevivencia de OCs (Liu y Zhang, 2015). En estudios rea- lizados en ratones con bloqueo de RANK o RANKL se produce una severa osteopetrosis con defectos en la erupción dental como con- secuencia de la falta de osteoclastos. Por otra parte, ratones sin OPG presentan una severa osteoporosis causada por el aumento en nú- mero y actividad de osteoclastos (Liu y Zhang, 2015). Se ha sugerido que OPG puede regular el tráfico intracelular de RANKL y, según esta hipótesis, cuando hay abundante OPG hace que la mayor parte de RANKL sinteti- zado se mantenga en el interior de vesículas intracelulares y, en consecuencia, inactivo. Por el contrario, en ausencia de OPG, RANKL se localizaría preferentemente en la membrana, donde es capaz de interactuar con los precursores osteoclásticos (Riancho y Delgado-Calle, 2011). La evidencia ha de- mostrado, que desórdenes del sistema RANKL/RANK/OPG están asociados a enfermedades del humano entre las que se incluyen osteoporosis, artritis reumatoide y tumores óseos (Liu y Zhang, 2015). En un estudio realizado para evaluar RANKL, la quemokina CXCL16 sobre-regula su expre- sión en artritis reumatoide y fibroblastos de la sinovia (Li et al., 2016). Por otra parte, las citoquinas inflama- torias TNF-α, IL-1, IL-6, IL-7, las cuales son abundantes en el líquido sinovial y sinovia de pacientes con artritis reumatoide, tienen una gran capacidad de inducir RANKL por los fibroblastos, por lo que aceleran su señaliza- ción contribuyendo al proceso de destrucción ósea (O´Brien et al., 2013). Las dos formas de RANKL, tanto la unida a membrana como la soluble, actúan como ligando agonistas de RANK donde RANKL se expresa en célu- las mesenquimales como OBs y células estromales de la médula ósea (Ariyoshi et al., 2014). En el hueso, la expresión de RANKL que es una proteína de membrana tipo II per- tenece a la superfamilia TNF, permite la ma- duración, diferenciación y activación de osteoclastos mediante unión a su agonista RANK, que es que es una proteína de mem- brana tipo I expresada en células precurso- ras de osteoclastos que traduce sus señales reclutando moléculas adaptadoras como el factor asociado al receptor TNF (TRAF) (Nakashima et al., 2012). RANK por su parte, es una molécula transmembrana expresada en células precur- soras de osteoclastos y osteoclastos madu- ros que carece de actividad enzimática in- trínseca en su dominio intracelular y genera señales por su unión a moléculas como fac- tor asociado al receptor TNF (TRAF) (Ariyoshi et al., 2014). En este contexto, TRAF6 es el principal adaptador molecular que liga RANK a la diferenciación y función de los OCs activando al complejo IkB kinasa (IKK) que induce fosforilación y degrada- ción de IkB (Boyce et al., 2015). La señali- zación intracelular de RANK con su interacción con RANKL induce la activación de su adaptador TRAF 6 y su inhibición de kinasas (IKKs) kB (IkB) NF-κβ (Boyce et al., 2015). Esto se basa en las observaciones en ratones deficientes en TRAF6 que falla- ron en diferenciarse al estado maduro in vitro en presencia de CSF-1 como de RANK-L desarrollando osteopetrosis (Liu y Zhang, 2015) y por un mecanismo que aún no se conoce, el complejo RANKL-RANK, indu- ce la trimerización con TRAF6 conduciendo a la activación del NF-kβ. RANK a su vez, es expresado por cé- lulas del linaje monocito macrófago entre las cuales se incluyen: células pre osteoclásticas, 7Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 Ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos células B y T, células dendríticas y fibro- blastos y es altamente expresado en la su- perficie de progenitores de OCs y OCs ma- duros, capaces de inducir la osteoclas- togénesis, mediada por la señal de RANKL, y que al carecer de capacidad de activación proteína kinasa intrínseca para mediarla, re- quiere de moléculas adaptadoras de unión al dominio intra citoplasmático de RANK don- de se incluyen a factores asociados a recep- tores TNF (TRAFs), que se unen a sitios es- pecíficos del dominio de RANK que activan moléculas en la cascada hacia el núcleo (Liu y Zhang, 2015). La cola citoplasmática de RANK con- tiene tres dominios de unión a TRAF6 y la unión de esta proteína a RANK induce la trimerización de TRAF6, el cual conduce a la activación de NF-kβ vía fosforilación e inactivación de kinasas K (IKK) (Liu y Zhang, 2015). Así, en pre-osteoclastos, TRAF6 ac- túa induciendo la expresión de la proteína activadora de los genes diana (AP1) y el Fac- tor de células T activado y calcineurina-1 dependiente (NFATc1), conducente a la fu- sión y diferenciación de pre-osteoclastos (Ng Kong y Martin, 2012; Stefaniuk-Szmukier et al., 2019). RANKL y algunas citoquinas proinfla- matorias, como el factor de necrosis tumoral, activan el factor nuclear kappa beta (NF-kβ) el cual es un factor de transcripción que re- gula la expresión de muchos genes invo- lucrados en la inflamación para lo cual nece- sita varias etapas de activación que requiere ubiquitinación (marcación de proteínas celu- lares para su proteólisis en el proteosoma) donde participa el factor de células T activador citoplasmático 1 (NFATc1) regulando la for- mación de los OCs y sus funciones, funda- mentalmente orientadas a la resorción ósea (Boyce et al., 2015; Levaot et al., 2015). La activación del NFATc1 es mediada por una fosfatasa específica, la calcineurina, la cual es activada por la señalización calcio- calmodulina (Nakashima et al., 2012). TNF-α es el principal mediador de la respuesta inflamatoria aguda y posee dos re- ceptores (TNF-RI y TNF-RII), los cuales, al ser activados activan varios factores de trans- cripción, fundamentalmente al NF-kβ, impor- tante para la transcripción de numerosos genes (Caggiano et al., 2013). De hecho, M- CSF, NF-kβ, RANKL y TNF son citoquinas expresadas/secretadas por células inmune que también regulan la osteoclastogénesis (Cuming et al., 2018). Por lo tanto, la vía de señalización RANKL-RANK-NF-kβ es la más importante (Figura 1), y permite la translocación del factor de transcripción NF- kβ al núcleo, liberándolo de los complejos IKK que lo retienen en el citoplasma, donde es inactivo (Boyce et al., 2015). El esquema básico de la señalización de NF-kβ consiste en una serie de elementos reguladores positivos y negativos induciendo estímulos que gatillen la activación de IKK conducentes a la fosforilación, ubiquitinación y degradación proteínas IkB, donde libera- dos los dímeros NF-Kb son activados y traslocados al núcleo donde se unen a se- cuencias específicas de DNA y promueven la transcripción de genes (Hayden y Gosh, 2008). El NF-β pertenece a una familia que expresa factores de transcripción, jugando un rol esencial en la mayoría de las respuestas inmunes e inflamatorias. En mamíferos, el NF-kβ consiste en seis miembros: Rel A (p65), Rel B, c-Rel, NF-kβ 1 (p50 y su pre- cursor p105), y NF-kβ 2 (p52 y su precursor p100) (Nakashima et al., 2012). Entonces, para que la señalización del NF-kβ se pro- duzca en el OC, se requiere de ubiquitinación y degradación proteosomal o procesamiento de proteínas inhibitorias IkBs (IkBα, IkBβ, IkBε), que les permiten unirse al NF-kβ. Así, IkBα, que se une a los heterodímeros RelA/ p50, es degradado, lo que permite, a través de estudios realizados en ratones knock-out, o con bloqueadores de RANKL, haber de- terminado que estos entren al núcleo (Boyce Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e200098 L. De Negri et al. et al., 2015). Al utilizar ratones knock-out o con bloqueadores de RANKL (ej. OPG), se sugirió que la formación de OCs asociada con inflamación es enteramente RANKL depen- diente, aun cuando otros factores pueden exacerbar la acción de RANKL y donde la mayor fuente de RANKL son las células estromales locales y por reclutamiento, acti- vación de macrófagos y células T presentes en el foco inflamatorio, lo cual se traduce en la producción local de citoquinas pro inflamatorias tales como TNF-α, Il-1 e Il-6 que estimulan la expresión de RANKL en OBs (Ng Kong y Martin, 2012). La traslocación al núcleo de NF-kβ re- quiere la liberación previa de los complejos IKK que lo retienen en el citoplasma donde es inactivo, de manera que en el núcleo acti- va la transcripción génica y la formación de productos que van a degradar el hueso (Boyce et al., 2015). La migración de precursores de osteoclastos al sitio de resorción ósea y su fusión en osteoclastos multinucleados madu- ros no está del todo resuelto, donde los osteocitos apoptóticos cercanos al microdaño liberan citoquinas como RANKL, demostran- Figura 1. Cascada de señalización durante la osteoclastogénesis. El receptor activador del li- gando del factor nuclear kB (RANKL) y su unión a RANK tiene como consecuencia el reclutamiento de factores de necrosis tumoral asociados a receptores como TRAF6 que activa al factor nuclear kB (NF-kB) y proteínas kinasas mitógeno activadas. RANKL también estimula la inducción de c-Fos a través de NF-kB y calcio/calmodulina. NF-kB y c-Fos son importantes para la fuerte inducción del factor nuclear de células T citoplasmáticas 1 (NFATc1) 9Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 Ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos do que los osteoclastos podrían migrar hacia las zonas de fluido con microdaño a través de canales de calcio determinando un nuevo mecanismo de reclutamiento y diferenciación de osteoclastos durante la resorción ósea y remodelación (Gao et al., 2019). Una vez que los osteoclastos finalizan la resorción ósea en una unidad de remode- lación, desaparecen por apoptosis donde los osteoblastos también sufren apoptosis y en parte se transforman en osteocitos, por lo que se presume que pueden ser los sensores del remodelado en microfracturas o cuando hay modificación de las fuerzas mecánicas (Riancho y Delgado-Calle, 2011). Por otra parte, la estimulación de la vía JNK promueve la formación y activación del complejo AP-1, formado por c-Fos y c-Jun que junto con AP-1 y NF-kβ, son capaces de inducir la expresión del factor de transcrip- ción NFATc1 (Riancho y Delgado-Calle, 2011), que para translocarse al núcleo y lle- var a cabo su función, requiere de un aumen- to del Ca+2 intracelular que provoca la acti- vación de calcineurina que cataliza la elimi- nación de un grupo fosfato de NFATc1 (Riancho y Delgado-Calle, 2011). En la literatura también se mencionan otros factores involucrados en la osteoclas- togénesis como IL-17 (Zupan et al., 2013), la cual induce la síntesis de RANKL en célu- las mesenquimales, tales como OBs y fibroblastos sinoviales incrementando la in- flamación local. Además, factores de creci- miento en el microambiente del hueso, donde la señalización del factor transformante beta 1 (TGF-β1) promueven la diferenciación de linfocitos T helper 17 (Th17) implicados en la destrucción ósea (Morita et al., 2016) y, que actuando directamente sobre macrófagos de la médula ósea, promueven la osteoclas- togénesis vía RANKL (Tanaka, 2017). Una vez finalizados los procesos de se- ñalización y que indujeron la osteoclas- togénesis como resultado de la interacción de RANKL con su receptor RANK, se acti- va la señalización de NF-kβ en precursores de osteoclastos y en osteoclastos maduros (Neyro et al., 2011), los que sufren cambios estructurales desarrollando un borde irregu- lar adosándose al hueso, formando una vacuola externa dentro de la cual son secretados iones de hidrógeno que acidifican el medio (Zupan et al., 2013), fosfatasa áci- da tartrato resistente que decalcifica el hue- so y catepsina K que destruye colágeno tipo I y MMP-9 que degrada otros componentes orgánicos (Okamoto y Takayanagi, 2011). Esta actividad, es amplificada por la expre- sión en los osteoclastos por canales de cloro y H+-ATPasa, acidificando el espacio extracelular (Adamopoulos y Mellins, 2015). De esta forma se mantiene un íntimo contacto con la superficie del hueso junto con la aparición de un anillo periférico de actina carente de organelos (zona clara o de sella- do) (Boyce et al., 2015). Luego, se forma una hemivacuola de resorción, donde los protones digieren el componente mineral del hueso y la hidrolasa ácida predominantemente catepsina K (proteasa lisosomal) digiere la matriz orgánica (colágeno tipo I) (Chambers y Fuller, 2011). También se libera MMP-9 que degrada otros componentes orgánicos del hueso cuyos productos, son tomados por el osteoclasto y liberados en su superficie apical hacia la circulación. Así, bombas de protones e hidrolasas, son insertadas en la superficie de la mem- brana formando una zona de sellado regula- da por la integrina β3 y de podosomas inter- conectados con filamentos de actina que con- centran las enzimas y iones de hidrógeno en la zona de la resorción, formándose una hemi- vacuola de resorción entre la célula y el hue- so, donde los protones digieren el componen- te mineral del hueso (Chambers y Fuller, 2011). Los osteoclastos también secretan fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), dentro del espacio de sellado, donde su fun- ción es decalcificar hueso (Mensah et al., 2009). El medio ácido creado por la secre- Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e2000910 L. De Negri et al. ción de iones de hidrógeno y TRAP ayudan a movilizar el contenido mineral del hueso. Así, los osteoclastos se mueven a lo largo de las superficies del hueso aumentando las lagu- nas de resorción hasta que el proceso se haya completado (Boyce et al., 2015). En el contexto descrito, al entender y extrapolar la información que se tiene de hu- manos, es dable pensar que en equinos pue- de suceder algo similar en los procesos don- de la excesiva actividad de OCs implica una resorción ósea patológica donde la evidencia demuestra que los OCs y células inmunes (Okamoto y Takayanagy, 2011) comparten una serie de moléculas moduladoras como citoquinas, receptores, moléculas de señali- zación y factores de transcripción que se influencian unos a otros. Kim et al. (2015) estima que la proteí- na C reactiva puede jugar un importante rol en el proceso de destrucción ósea en artritis reumatoide a través de la inducción de la ex- presión de RANKL y una directa diferencia- ción de precursores de osteoclastos en osteoclastos maduros. Así, pacientes tratados con artritis reumatoide tienen posibilidad de re- ducir los niveles séricos de PCR puede preve- nir la destrucción ósea (Kim et al., 2015). Recientemente, se encontró una mayor densidad de OCs en muestras de OA postraumática localizada en carpo de equinos de carrera comparadas con controles, los cuales de preferencia se localizaron en el plato subcondral y que RANKL correlacionaba positivamente con la degeneración del cartí- lago y la densidad de osteoclastos. Esto plan- teaba que RANKL del cartílago puede tener un rol en el reclutamiento de osteoclastos y en el cartílago articular calcificado, lo que correlacionó con el número de microfracturas, sugiriendo que el reclutamiento de OCs por RANKL puede contribuir en la degeneración de cartílago articular calcificado (Bertuglia et al., 2016). También la alteración del paso de fluido entre el cartílago a través de la interfase hueso- cartílago, podría afectar el medio mecánico y químico promoviendo la progresión de la OA, sugiriendo que hay un aumento de la porosidad del plato subcondral, lo cual aumenta la interacción entre los compartimientos del hue- so y del cartílago (Findlay y Kuliwaba, 2016). En este contexto se ha logrado inhibir selectivamente catepsina K, logrando un promisorio potencial terapéutico en OA, específicamente en equinos que cursan con dolor óseo, e inflamación que resultan en ex- cesiva resorción ósea y periostitis mediante un selectivo inhibidor VEL-O230 que dismi- nuye la resorción ósea y aumenta la forma- ción de biomarcadores óseos (Hussein et al., 2017). Por otra parte, la secreción de fosfatasa ácida resistente al tartrato, dentro del espa- cio de sellado, donde su función es decalcifi- car hueso (Mensah et al., 2009), utilizando doxiciclina y eritromicina las cuales tiene efec- tos inhibidores de la resorción ósea en el saco alveolar de ratas, se encontró una expresión génica de RANKL significativamente dismi- nuida y un menor número de células produc- toras de TRAP lo que implicó una menor ac- tividad osteoclastogénica (Naghsh et al., 2016). También se ha establecido que la inhibi- ción de las vías moleculares intracelulares por efectos directos de crocina sobre OCs in vitro, la osteoclastogénesis al ser suprimida, puede contribuir al desarrollo futuro de un tra- tamiento anti-resorción ósea (Fu et al., 2016). Es así que, la supresión de la resorción ósea excesiva es una de las estrategias para tratar la enfermedad ósea, para lo cual la utiliza- ción de fumitremorgin C (micotoxina extraí- da de Aspergillus fumigatus) suprime las vías de señalización de RANKL (Yuan et al., 2020). 11Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 Ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos Uso de Antiinflamatorios en Osteoartritis En la práctica, el manejo clínico y tera- péutico de la OA es diverso, donde la mayo- ría de los tratamientos convencionales consi- deran el uso de antiinflamatorios no esteroi- dales conducentes a disminuir la inflamación y las claudicaciones (Barton, 2016; Orsini et al., 2012), y corticoides con el objetivo de mitigar el dolor, las alteraciones tisulares en el hueso subcondral, cartílago articular y mem- brana sinovial (Lacourt et al., 2012; de Souza, 2016; McIlwraith y Lattermann, 2019) indu- cidos por la acción de IL-1, MMPs, agrecanasas, PG E2 y radicales libres. Un se- guimiento clínico comparativo en 80 equinos con claudicación, tres semanas pos-adminis- tración de triamcinolona intra-articular fue exitoso en un 87.8%, mientras que a los que se les administró triamcinolona con ácido hialurónico fue de 64.1% (de Grauw et al., 2014). La actividad antiinflamatoria de los corticoides resulta de la transcripción/trans- represión sobre al menos 200 genes y el me- canismo es la inducción de lipocortín que inhibe fosfolipasa 2, enzima responsable en la cascada del ácido hialurónico y, finalmen- te, la producción de mediadores proinfla- matorios tromboxanos, leucotrienos y prosta- glandinas (Cuming et al., 2018). Por el con- trario antiinflamatorios no esteroidales solo inhiben la vía ciclooxigenasa (Bentz, 2015). Los esteroides, además son inhibidores importantes de la inflamación que actúan en la vía de señalización del factor nuclear kappa β (NF-kβ); sin embargo, su inhibición puede ser desfavorable porque este factor regula la expresión de genes inflamatorios y matriz extracelular (expresión de colágeno tipo II y agrecano) (de Souza, 2016). Es así que el medir la expresión génica utilizando métodos farmacogenómicos se proporciona una eva- luación más global de todas las respuestas farmacodinámicas después de una adminis- tración intraarticular de corticoides (McIlwraith, 2011). En humanos, la terapia crónica con corticoides es conocida como una de las ma- yores causas de osteoporosis (Neve et al., 2011) al inhibir la proliferación y actividad de osteoblastos, incrementando su apoptosis jun- to a la de osteocitos. Además, incrementan la expresión de RANKL, la diferenciación y proliferación de osteoclastos y disminuyen la síntesis de OPG (Liu y Zhang, 2015). Los corticoides que se utilizan vía intraarticular con mayor frecuencia son triamcinolona, dexametasona, metilpred- nisolona, betametasona y prednisolona (de Souza, 2016), que se recomiendan con base a los efectos directos sobre el dolor, como en la liberación de Il-1, metaloproteinasas, agrecanasas, prostaglandinas E2 (PGE-2) y radicales libres que pueden ser conducentes a la degradación del cartílago articular y con- secuente OA (McIlwraith, 2011). En este contexto, Whitton et al. (2014) describen que un 47% de los caballos a los cuales se les administró corticoides en carpo presentaron lesiones pos-administración, y Smith et al. (2018) describen que de 1488 caballos que recibieron medicamentos intra-articulares en un periodo de cinco años en 8692 espacios intraarticulares tratados en 3925 sesiones, ocurrieron 96 fracturas dentro de los prime- ros 56 días de tratamiento. El beneficio animal in vivo de triamcinolona ocurre a dosis usualmente de 8-12 mg como dosis total para el crecimiento de células y recuperación del daño (Wernecke et al., 2015). Por otra parte, de Souza (2016) describe dosis condropro- tectivas de 6-18 mg en articulaciones alta- mente móviles. Las evidencias han demostrado lo des- crito como «artropatía esteroidal», caracteri- zada por inestabilidad articular, disminución del espacio articular, crepitación, osteo- necrosis con mayor incidencia de lesiones en caballos de carrera, (Bentz, 2015). Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e2000912 L. De Negri et al. En casos humanos, donde se ha utiliza- do triamcinolona acetonide de liberación pro- longada intraarticular en el manejo del dolor de rodilla permite una larga presencia en sinovia, produce bajos niveles de glucosa san- guínea, disminuye el dolor en los pacientes y es generalmente bien tolerada (Paik et al., 2019). Además del alivio del dolor, hay una mejora funcional mediante una dosis intraarticular de 40 mg (Borkar et al., 2018) de preferencia a dosis bajas (Bentz, 2015). Sin embargo, los glucocorticoides al dismi- nuir la actividad de los osteoblastos inducen una pérdida ósea condicionando una osteoporosis secundaria, acción mediada en parte por la PTH y 1,25 OH colecalciferol (Neyro et al., 2011). Para evitar múltiples administraciones y riesgos desbalances hor- monales, se han utilizado microesferas de una plataforma de poliéster cargada con triamci- nolona acetonida (Rudnik-Jansen et al., 2017). Como alternativas complementarias en equinos se utiliza ácido hialurónico, parcial- mente responsable de la lubricación y visco elasticidad del fluido sinovial, cuyo peso molecular disminuye con la edad (Gupta et al., 2019) y en tratamientos no quirúrgicos (Ariyoshi et al., 2014). Una combinación de N-acetil D-glucosamina y condroitín sulfato de sodio utilizando un modelo equino resultó en una mejora de 16% en el dolor clínico ba- sado en scores de claudicación. En este mo- delo, la reducción clínica en claudicación con acetidrona acetonide fue de 56% (Frisbie et al., 2013). El uso de terapias regenerativas, basa- das en plasma rico en plaquetas (McCarrel y Fortier, 2009; Sundman et al., 2011), células madre o suero autólogo, presentan resulta- dos controversiales en su utilización (Frisbie, 2011; Monteiro et al., 2015) debido a la es- casa casuística clínica y ausencia de publica- ciones relacionadas con el tratamiento de la enfermedad articular en equinos (Fortier, 2011). En humanos se describe algo similar (Grassel y Lorenz, 2014). En modelo equino, se han provocado defectos de 15 mm en la patela aplicándose células madre embebidas en fibrina autóloga, encontrándose en las biopsias a los 30 días posteriores un aumento de colágeno tipo II (Grassel y Lorenz, 2014). McIIwraith et al. (2012) solo mostraron un cambio significati- vo en los niveles de PG E2 en el líquido sinovial, lo que no fue considerado suficiente para re- comendar su uso en OA. También se ha eva- luado el uso de Stanozolol en 60 equinos con OA con resultados positivos, obteniéndose 82% de mejoría en casos agudos y crónicos (Spadari et al., 2015). El uso de Tiludronato o Clodronato bifosfonatos no nitrogenados, que se unen a los cristales de fosfato de calcio inhibiendo la resorción ósea (Xie et al., 2019), son devuel- tos a circulación por resorción osteoclástica para finalmente adherirse nuevamente al hue- so en un proceso llamado «reattachment» (Soto y Chiappe, 2014). En casos de enfer- medad navicular, disminuye los signos de clau- dicación (Dusterdieck-Zellmer, 2018). La medicación con bisfosfonatos en caballos de carrera jóvenes y adultos es materia de dis- cusión debido a que esas moléculas se man- tienen unidas a la matriz mineralizada del hue- so, pudiendo interferir con su crecimiento, adaptación al ejercicio y la reparación del microdaño del hueso (Gilday et al., 2020). Otra opción es el suero autólogo de pro- teína antagonista del receptor de IL-1 (IRAP), donde IRAP II está siendo evaluado (Monteiro et al., 2015). IRAP e IRAP II tienen signifi- cativas concentraciones para el receptor de la citoquina inflamatoria (IL-1 Ra) y de los factores de crecimiento IGF-1 y TGF-B (McIlwraith, 2015). Nakashima et al. (2012) consideran que terapias anti-RANKL son beneficiosas en la inhibición de la pérdida de hueso sin afectar el sistema inmune en ensayos clínicos en el modelo animal con OA. Así, se describe que ratones deficientes en RANKL son resisten- 13Rev Inv Vet Perú 2021; 32(2): e20009 Ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) en osteoartritis y osteoclastogénesis de equinos tes a la pérdida de hueso inducida por la in- flamación. A futuro, las posibilidades de re- cuperación articular y obtener la capacidad de respuesta a un tratamiento, RANKL y su receptor RANK bloqueando RANKL, se inhibe la vía de NF-kβ disminuyendo la infla- mación (Hamoudi et al., 2019). Por otra par- te, Chen et al. (2019) estiman que los niveles séricos de OPG y RANKL también pueden ser usados como potenciales biomarcadores. Facilitar el diagnóstico precoz de OA puede ser crítico en el tratamiento y progre- sión de la enfermedad (Kamm et al., 2013), evitando alteraciones metabólicas del tejido articular, ofreciendo una anticipada informa- ción de utilidad en la clínica equina (Chávez et al., 2010) y podría ser un medio ideal de monitoreo del progreso o control del cuadro articular. En este contexto, la inhibición se- lectiva de Catepsina K también tiene un po- tencial terapéutico en la pérdida de hueso e inflamación en los casos de osteoartritis (Hussein et al., 2017). En la actualidad, el uso de biomar- cadores son un desafío para identificar el daño articular precoz, medición que se pueda realizar en sangre, suero, plasma, orina o fluido sinovial. Sin embargo no hay un biomarcador conocido de alta precisión que indique el gra- do de enfermedad del cartílago y hueso en una articulación (Stefaniuk-Szmukier et al., 2019). Independiente de las investigaciones realizadas al respecto, la evaluación de RANKL in vivo como activador de la dife- renciación y activación de osteoclastos, se cuantificó por primera vez en líquido sinovial equinos fina sangre de carrera en la articula- ción carpal de caballos clínicamente sanos y con osteoartritis encontrándose diferencias significativas de los valores de RANKL en caballos sanos vs caballos con OA (De Negri et al., 2019). En este contexto, poder detectar daño articular en una etapa incipiente antes que los métodos convencionales, y su progresión, se podrían predecir a futuro las posibilidades de la recuperación articular y/o tener la ca- pacidad de evaluar la respuesta a un trata- miento. LITERATURA CITADA 1. Abdelmagid SM, Barbe MF, Safadi FF. 2015. Role of inflammation in the aging bones. Life Sci 123: 111-120. doi: 10.1016/j.lfs.2014.11.011 2. Adamopoulos IE, Mellins ED. 2015. Alternative pathways of osteoclas- togenesis in inflammatory arthritis. Nat Rev Rheumatol 11: 189-194. doi: 10.1038/ nrrheum.2014.198 3. Al-Bari A, Al Mamun A. 2020. Current advances in regulation of bone homeos- tasis. FASEB Bioadv 2: 668-679. doi: 10.1096/fba.2020-00058. 4. Ariyoshi W, Okinaga T, Knudson CB, Knudson W, Nishihara T. 2014. High molecular weight hyaluronic acid regulates osteoclast formation by inhibi- ting receptor activator of NF-kB ligand through Rho kinase. 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